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双缩脲是一种用于分析蛋白质的方法，双缩脲反应的原理是在呈蓝色的碱性硫酸铜溶液存在的情况下，铜离子与肽键形成有色螯合的铜复合物，呈紫色，所产生的颜色密度与参与反应肽键数成比例，可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。双缩脲法测定蛋白浓度兼容性亦很好，不受大部分样本中其他成分的影响，但易受铜离子螯合剂影响，另外对于血清总蛋白的双缩脲分析，胆红素、脂类、血红蛋白、葡聚糖具有一定干扰作用。

双缩脲总蛋白试剂由硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠等组成，在10～160mg/mL浓度范围内有较好的线性关系，是对蛋白质的精确定量分析试剂。该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

• 待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中，否者待测蛋白与蛋白标准中所含非蛋白成分不一致，有可能导致测定不准确。
  
• 待测蛋白和蛋白标准加入双缩脲试剂后，如果发现检测效果不佳，可以室温放置1h或60℃放置15min，颜色会随着时间的延长不断加深，显色反应也会随温度升高而加快。如果浓度较低，可以适当延长孵育时间或在较高温度下孵育。
  
• 测定标准曲线时发现随着标准品浓度的增加吸光度或颜色没有明显变化，可能的原因是样品中含有铜离子螯合剂。
  
• 建议每次测定时都做标准曲线。因为颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。
  
• 如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色皿的最小检测体积，应按比例适当加大双缩脲试剂的用量使总体积不小于最小检测体积，样品和标准品的用量亦相应按比例放大。使用分光光度计测定蛋白浓度时，每个试剂盒可以测定的样品数量可能会显著减少。
  
• 检测中发现所有孔都呈暗紫色，可能原因是样品含有还原剂，应适当透析或稀释样品。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 配制成160mg/mL的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中；例如待测蛋白溶解于蔗糖中，亦取蛋白标准溶解于蔗糖中，一般也可以用0.9% NaCl或PBS作为溶解BSA稀释液。
  
• 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔，加稀释液补足至20μL。
  
• 加适当体积待测蛋白样本到96孔板的样品孔中，如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液不同，应在待测蛋白样本孔中加入20μL稀释液；如果标准品稀释液与溶解待测蛋白样本的溶液相同，无需在待测蛋白样本孔中加入20μL稀释液。
  
• 各孔加入200μL双缩脲总蛋白试剂，室温放置10～15min。
  
• 测定540nm波长处的吸光值，如无540nm，520～562nm之间的波长也可，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。